Микроскоп

Алан-э-Дейл       22.10.2022 г.

На английском языке[править | править код]

  • Коллекция старинных микроскопов
  • Historical microscopes, an illustrated collection with more than 3000 photos of scientific microscopes by European makers (German)
  • Металл-микроскоп (Metallurgical microscope) SubsTech — free and open knowledge source in Materials Engineering
  • Molecular Expressions, концепции оптической микроскопии
  • Online — руководство по практике оптической микроскопии
  • Видео — оптическая микроскопия
  • Structure Magazine
  • Microscopy Information Easily understandable articles relating to optics, techniques and specimen preparation.
  • OpenWetWare
  • CurrentProtocols

§ 3. Устройство микроскопа и техника микроскопирования

Для исследования дрожжей, бактерий и плесневых грибов применяют микроскопы, предназначенные для рассмотрения прозрачных препаратов в проходящем свете (рис. 8).

Рис. 8. Микроскоп МБИ-1: 1 — зеркало, 2 — конденсор, 3 — предметный столик, 4 — объективы, 5 — револьвер, 6 — окуляр, 7 — тубус, 8 — тубусодержатель, 9 — макрометрический винт, 10 — микрометрический винт, 11 — ножка

Оптическая часть микроскопа. Основной частью оптической системы микроскопа является объектив, увеличивающий изображение предмета. Он состоит из ряда линз, склеенных канадским бальзамом и заключенных в металлическую трубку; на трубке имеется резьба, при помощи которой объектив ввинчивается в специальное гнездо револьвера.

Изображение, даваемое объективом, рассматривают с помощью окуляра, находящегося в верхней части тубуса микроскопа. Биологические микроскопы снабжаются тремя сменными окулярами. На верхней оправе линзы окуляра указано его увеличение. Обычно окуляры дают увеличение в 7, 10 и 15 раз. Общее увеличение объекта микроскопом равно произведению увеличения окуляра на увеличение объектива = 900 раз.

Осветительное устройство располагается под столиком микроскопа и состоит из конденсора с ирис-диафрагмой и зеркала.

Механическая часть микроскопа. Эта часть состоит из штатива, тубусодержателя с револьвером, винтов для передвижения тубуса (макрометрического и микрометрического), осветительного аппарата и предметного столика микроскопа. Основными частями штатива являются нижняя подставка (ножка), придающая микроскопу устойчивость, и тубусодержатель микроскопа.

Техника микроскопирования. Прежде чем начать микроскопирование, необходимо установить правильное освещение. Для этого с микроскопа снимают окуляр и, глядя прямо в объектив, устанавливают зеркало так, чтобы источник света (лампа или окно) были видны посредине объектива. После предварительной установки света на предметный столик микроскопа кладут готовый препарат и закрепляют его зажимами. При помощи макрометрического винта опускают тубус почти до соприкосновения с покровным стеклом. Затем, глядя в окуляр, постепенно поднимают тубус до появления изображения. Для наведения резкости пользуются микрометрическим винтом.

При микроскопиравании следует держать оба глаза открытыми. Смотрят в микроскоп левым глазом.

Техника приготовления препарата для микроскопирования

Каплю исследуемой жидкости наносят на чистое предметное стекло и осторожно накрывают покровным стеклом. Если препарат готовят с плотной питательной среды, то на предметное стекло наносят капельку чистой водопроводной воды, в нее помещают исследуемую культуру и препарат накрывают покровным стеклом

Под последним не должно оставаться пузырьков воздуха, так как они мешают микроскопированию. Избыток жидкости, выступающий из-за покровного стекла, убирают фильтровальной бумагой, заранее нарезанной небольшими узкими полосками. Готовый препарат помещают на предметный столик и исследуют.

Техника посевов на питательные среды и состав сред описаны в разделе «Микробиологический контроль».

Краткая историческая справка

Флуоресценцию открыл Джордж Стокс в 1852 г. Английский физик наблюдал ее у хининовых веществ. Позже ученые выяснили, что облучение ультрафиолетом приводит к свечению многих соединений. Флуоресценция характерна для витаминов, кристаллов, горных пород, масел и хлорофилла. Однако полученные сведения применили позднее.

В 1930-х гг. ученые-биологи стали окрашивать бактерии и клетки флюорохромами, способствующими свечению. Был придуман микроскоп для подобных исследований.

Применение флуоресценции позволило изучать микрообъекты с разрешением от 1 до 10 нм. Наноскопия может раскладывать частицы на отдельные молекулы.

История создания

Хотя первые увеличительные линзы, на основе которых собственно и работает световой микроскоп, археологи находили еще при раскопках древнего Вавилона, тем не менее, первые микроскопы появились в Средневековье. Что интересно, среди историков нет согласия по поводу того, кто первым изобрел микроскоп. Среди кандидатов на эту почтенную роль такие известные ученые и изобретатели как Галилео Галилей, Христиан Гюйгенс, Роберт Гук и Антонии ван Левенгук.

Стоит также упомянуть итальянского врача Г. Фракосторо, который еще в далеком 1538 году первым предложил совместить несколько линз, чтобы получить больший увеличительный эффект. Это еще не было созданием микроскопа, но стало предтечей его возникновения.

А в 1590 году некто Ханс Ясен, голландский мастер по созданию очков заявил, что его сын – Захарий Ясен – изобрел первый микроскоп, для людей Средневековья такое изобретение было сродни маленькому чуду. Однако, ряд историков сомневается в том, является ли Захарий Ясен истинным изобретателем микроскопа. Дело в том, что в его биографии немало темных пятен, в том числе пятен и на его репутации, так современники обвиняли Захарию в фальшивомонетчестве и краже чужой интеллектуальной собственности. Как бы там ни было, но точно узнать был ли Захарий Ясен изобретателем микроскопа или нет, мы, к сожалению, не можем.

А вот репутация Галилео Галилея в этом плане безупречна. Этого человека мы знаем, прежде всего, как, великого астронома, ученого, гонимого католической церковью за свои убеждения о том, что Земля вращается вокруг Солнца, а не наоборот. Среди важных изобретений Галилея – первый телескоп, с помощью которого ученый проник своим взором в космические сферы. Но сфера его интересов не ограничивалась лишь звездами и планетами, ведь микроскоп, это по сути тот же телескоп, но только наоборот. И если с помощью увеличительных линз можно наблюдать за далекими планетами, то почему бы не обратить их мощь в другое направление – изучить то, что находится у нас «под носом». «Почему бы и нет», – наверное, подумал Галилей, и вот, в 1609 году он уже представляет широкой публике в Академии деи Личеи свой первый составной микроскоп, который состоял из выпуклой и вогнутой увеличительных линз.

Старинные микроскопы.

Позднее, спустя 10 лет, голландский изобретатель Корнелиус Дреббель усовершенствовал микроскоп Галилея, добавив в него еще одну выпуклую линзу. Но настоящую революцию в развитии микроскопов совершил Христиан Гюйгенс, голландский физик, механик и астроном. Так он первым создал микроскоп с двухлинзовой системой окуляров, которые регулировались ахроматически. Стоит заметить, что окуляры Гюйгенса применяются и по сей день.

А вот знаменитый английский изобретатель и ученый Роберт Гук навеки вошел в историю науки, не только как создатель собственного оригинального микроскопа, но и как человек, сделавший при его помощи великое научное открытие. Именно он первым увидел через микроскоп органическую клетку, и предположил, что все живые организмы состоят из клеток, этих мельчайших единиц живой материи. Результаты своих наблюдений Роберт Гук опубликовал в своем фундаментальном труде – Микрографии.

Опубликованная в 1665 году Лондонским королевским обществом, эта книга тут же стала научным бестселером тех времен и произвела подлинный фурор в научном сообществе. Еще бы, ведь в ней имелись гравюры с изображением увеличенной в микроскоп блохи, вши, мухи, комара, клетки растения. По сути, этот труд представлял собой удивительное описание возможностей микроскопа.

Интересный факт: термин «клетка» Роберт Гук взял потому, что клетки растений ограниченные стенами напомнили ему монашеские кельи.

Так выглядел микроскоп Робета Гука, изображение из «Микрографии».

И последним выдающимся ученым, который внес свой вклад в развитие микроскопов, был голландец Антонии ван Левенгук. Вдохновленный трудом Роберта Гука, «Микрографией», Левенгук создал свой собственный микроскоп. Микроскоп Левенгука, хотя и обладал лишь одной линзой, но она была чрезвычайно сильной, таким образом, уровень детализации и увеличения у его микроскопа был лучшим на то время. Наблюдая в микроскоп живую природу, Левенгук сделал множество важнейших научных открытий в биологии: он первым увидел эритроциты, описал бактерии, дрожжи, зарисовал сперматозоиды и строение глаз насекомых, открыл инфузории и описал многие их формы

Работы Левенгука дали огромный толчок к развитию биологии, и помогли привлечь внимание биологов к микроскопу, сделали его неотъемлемой частью биологических исследований, аж по сей день. Такая в общих чертах история открытия микроскопа

Подробно о конструкции и принципе работы микроскопа

Устройство разработано на базе традиционного оптического микроскопа, но имеет иной принцип работы. Исследуемый образец помечают люминесцирующими веществами, а затем с помощью сложной системы фильтров собирают испускаемые фотоны и визуализируют микрообъекты.

Устройство микроскопа

В основном прибор обладает всеми модулями, характерными для оптических микроскопов. Однако он, в отличие от них, оснащен флуоресцентным модулем.

Задачами данного технологического узла являются направление возбуждающего излучения на образец и последующее отделение отраженного света от общего потока. Для этого используется сложная система фильтров, объединенных в единый блок.

Такие приборы плохо подходят для возбуждения флуоресцирующих красителей, поглощающих излучение в коротковолновом диапазоне. Вместо них применяют галогенные или светодиодные лампы.

Устройство флуоресцентного микроскопа.

Конструкция фильтров-блоков

В основе конструкции микроскопа лежит блок, включающий набор следующих оптических элементов:

  • фильтра возбуждения;
  • дихроичного светоделителя;
  • эмиссионного фильтра.

Фильтр возбуждения принимает излучение от источника света, пропуская длины волн заранее установленного диапазона. Дихроичное зеркало сначала отражает фотоны через оптический объектив на образец, а затем направляет флуоресценцию к системе обнаружения. Далее на пути испускаемого излучения стоит эмиссионный фильтр, который блокирует нежелательные волны.

При установке фильтров важно обеспечить правильный угол наклона и ориентацию относительно светового пути, чтобы эффективно управлять фотонным потоком. Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки

Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки.

Конструкция и спектральная характеристика фильтр-блоков.

Используемые осветители

В качестве источников света люминесцентные микроскопы чаще используют галогенные лампы. Они имеют небольшие размеры, хорошую цветопередачу и невысокую стоимость. Однако из-за низкой яркости и малого срока службы эти устройства постепенно вытесняются светодиодными LED-элементами.

Источники света на основе LED-технологии считаются самыми востребованными в современной микроскопии. Это универсальные полупроводниковые осветители, обладающие широким набором спектральных характеристик. Они позволяют использовать излучение в диапазоне от ультрафиолетовой до ближней инфракрасной зоны.

Это надежные и непрерывно работающие установки, обладающие наиболее высокими значениями яркости по сравнению галогенными и светодиодными приборами.

Однако они имеют ряд существенных недостатков: малый срок службы, изменение спектральной характеристики с возрастом и продолжительные интервалы между выключением и включением.

Спектральная интенсивность ртутной лампы НВО 100.

Флуоресцентные камеры

Камера считается одним из важнейших и самых дорогих компонентов микроскопа. Она должна обладать высокой чувствительностью и низким уровнем шума, чтобы захватить как можно больше фотонов.

Для флуоресцентной визуализации предпочтительно монохромное устройство, которое обеспечивает одинаковое обнаружение сигналов на всех пикселях и увеличивает общую чувствительность.

Они преобразуют волновые сигналы в электрические заряды, которые поступают на усилитель, а затем передаются в аналогово-цифровой преобразователь.

В CCD-камерах все сигналы сканируются одновременно, что позволяет снизить уровень шума и повысить чувствительность. В sCMOS-устройствах считывание происходит произвольно, вследствие чего возникают нежелательные вибрации, искажается геометрия объектов при визуализации.

Выбор камеры зависит от типа исследуемых образцов, требуемой частоты кадров, угла обзора, разрешения и чувствительности. Например, для промышленных изысканий необходимы высокое качество изображений и скорость работы, а для медико-биологических исследований важнее чувствительность устройства.

Высокочувствительные камеры с большим разрешением.

Обозначения для фильтров

Производители разрабатывают собственные системы кодов для обозначения фильтров, используемых во флуоресцентной микроскопии, что нередко приводит к путанице в терминологии. Кодировка в основном отражает вещественный состав изделия или его функциональные свойства.

При маркировке фильтров возбуждения часто используют аббревиатуры UG и BG, обозначающие ультрафиолетовое и синее стекла соответственно.

Дихроичные светоделители маркируются следующими акронимами: DM — дихроичное зеркало, CBS — хроматический светоделитель, TK — щелевой делитель, FT — делитель цвета, RKP — узкополосный отражатель. Все эти обозначения взаимозаменяемы.

Эмиссионные фильтры кодируются следующими символами: L или LP — широкополосный элемент, GG или Y — желтое стекло, OG или O — оранжевое стекло, RG или R — красное стекло, BA — запирающее стекло, K — щелевой фильтр.

Иногда наряду с акронимом присутствует числовое значение, указывающее на длину волны в нанометрах, на которой фильтр достигает половины величины максимальной пропускной способности.

Флуоресцентный светофильтр.

Главные характеристики линзы

На практике используются линзы различных размеров, вогнутые и выпуклые, с маленьким радиусом кривизны и большим. Чаще других линзы встречаются в обыкновенных очках. Интересно то, что очки, хорошо помогающие видеть одному человеку, абсолютно не подходят другому. Почему? Объясняется это явление важнейшими характеристиками линз: фокусным расстоянием и оптической силой.

Различные линзы.  

Фокусное расстояние связано с радиусами поверхностей, образующих линзу. Проще говоря, чем более выпуклыми являются поверхности, тем меньше фокусное расстояние. Такие линзы сильнее преломляют лучи и дают большее увеличение. Соответственно линзы с менее выпуклыми поверхностями имеют большее фокусное расстояние, слабее преломляют лучи и дают меньшее увеличение.

Собирающие линзы обладают положительной оптической силой.

Так как у рассеивающих линз фокус мнимый, условно принято считать фокусное расстояние отрицательным и оптическую силу таких линз тоже отрицательной.

В большинстве устройств оптики применяется сразу несколько линз, образующих систему. Общая оптическая сила определяется как сумма оптических сил всех входящих в систему линз.

D = D1 + D2 + D3 + … + Dn

Буквой n обозначено количество использованных линз.

Разнообразие линз беззеркальной камеры.  

Общие сведения[править | править код]

Человеческий глаз представляет собой естественную оптическую систему, характеризующуюся определённым разрешением, т. е. наименьшим расстоянием между элементами наблюдаемого объекта (воспринимаемыми как точки или линии), при котором они ещё могут быть различимы один от другого. Для нормального глаза при удалении от объекта на т. н. расстояние наилучшего видения (D = 250 мм), среднестатистическое нормальное разрешения составляет 0,176 мм.

Улучшить условия наблюдения можно с помощью оптических приборов, в простейшем случае — лупы. Однако размеры микроорганизмов, большинства растительных и животных клеток, мелких кристаллов, деталей микроструктуры металлов и сплавов и т. п. значительно меньше этой величины.

Для наблюдения и изучения подобных объектов предназначены микроскопы различных типов. С помощью микроскопов определяют форму, размеры, строение и многие другие характеристики микрообъектов. Объекты для микроскопии подготавливают и сохраняют в виде специальных микроскопических препаратов, которые можно фиксировать, окрашивать, фотографировать для дальнейшего изучения (микрофотография).

До середины ХХ века работали только с видимым светом, оптическим излучением в диапазоне 400—700 нм, а также с ближним ультрафиолетом (люминесцентный микроскоп). Оптические микроскопы не могли давать разрешающей способности менее полупериода волны опорного излучения (диапазон длин волн 0,2—0,7 мкм, или 200—700 нм), потому максимальное увеличение, которого можно было добиться, составляло ~2000 крат. То есть способность различать структуры с расстоянием между точками до ~0,20 мкм. (хотя в ультрамикроскопе можно обнаружить объекты меньшего размера, их структуру изучить невозможно).

Но это было до 2006 года.

В 2006 году немецкие ученые Штефан Хелль (Stefan Hell) и Мариано Босси (Mariano Bossi) из Института биофизической химии разработали оптический микроскоп, позволяющий наблюдать объекты размером около 10 нм и получать высококачественные трехмерные 3D изображения (см. в журнале Angewandte Chemie). Увидеть объекты размером менее 200 нанометров (минимальной длины волны ближнего ультрафиолетового излучения) было возможно только при помощи неоптических методов (например, электронной микроскопии}, однако эти методы имели свои ограничения, в частности, в отличие от оптических не позволяли работать с целыми и тем более живыми клетками. Ученые применили метод микроскопии, в котором молекулы при помощи специально подобранного очень короткого импульса переводятся из «темного» состояния в «светлое», при котором они излучают энергию, люминесцируют. Излучаемый свет фиксируется и тем самым выдает данные об объектах размером значительно меньше 200 нанометров. Эта разработка позволила взглянуть в микромир живых клеток на атомно- молекулярном уровне в трехмерном пространстве 3D с разрешением изображений в 1-10 нм!

Принцип работы

Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) — это тип электронного микроскопа, который изображает образец, сканируя его сфокусированным пучком заряженных электронов в растровом сканирующем узоре (прямоугольном узоре захвата и реконструкции изображения). Различные сигналы, которые могут быть обнаружены, когда электроны взаимодействуют с атомами в образце, где сигналы могут быть интерпретированы в информацию о свойствах поверхности образца. Затем положение луча комбинируется с обнаруженным сигналом для получения изображения. СЭМ может достигать разрешения лучше, чем 1 нанометр. Образцы можно наблюдать в высоком вакууме, в низком вакууме, во влажных условиях, в окружающей среде, а также в широком диапазоне криогенных или повышенных температур.

Наиболее распространенным режимом СЭМ является обнаружение вторичных электронов, испускаемых атомами, возбужденными электронным пучком. Количество вторичных электронов зависит от угла, под которым пучок встречается с поверхностью образца. При сканировании образца и сборе вторичных электронов с помощью специального детектора создается изображение, отображающее топографию поверхности.

Как следует из названия, СЭМ использует электронную пушку, которая испускает сфокусированный пучок электронов высокой энергии, заменяющий источник света, используемый в оптическом микроскопе.

Достоинства

  • Сила увеличения составляет около 300 000 х по сравнению с несколькими сотнями раз, которые производит оптический.
  • Обеспечивает большую глубину резкости по сравнению с оптическими, что позволяет сложным 3D-объектам оставаться четкими и в фокусе.
  • Можно делать высококачественные цифровые фотографии всего, что видно в это устройство.

Недостатки

  • Недостатки обычного СЭМ заключаются в том, что образец должен быть твердым и небольшим, чтобы он мог поместиться внутри камеры.
  • Очень легкие элементы, такие как H, He, Li и элементы, которые находятся ниже атомного номера 14, не могут быть обнаружены с помощью этого типа.
  • Самые дешевые стоят около десятков тысяч долларов и являются достаточно громоздкими и сложными инструментами, требующими высокой технической экспертизы и подготовки при обращении.

Таким образом, эти факты ограничивают использование при исследованиях и промышленном применении.

Что такое люминесцентная микроскопия

При физическом процессе соединения поглощают фотоны. Одновременно у веществ появляется излучение с иной длиной волны. У получившихся фотонов она больше, но энергии меньше. Когда соединения облучают ультрафиолетом, отдельные из них светятся. Цвет излучения направлен к красной спектральной части.


Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться.

Люминесцентные устройства функционируют в отраженном свете. Основной задачей при применении флуоресценции является отделение потока света объекта от сильного излучения подсветки. Чтобы увеличить наглядность изображения, используется темный или черный фон.

Как работает микроскоп

В работе микроскопа присутствует тот же принцип, что и в телескопе-рефлекторе. В телескопе лучи света, когда проходят через стекло или стеклянную линзу, преломляются под определённым углом. Телескоп собирает параллельные лучи воедино в точку фокуса, откуда с помощью окуляра мы можем её видеть. Что касается микроскопа, то тут очень схожий принцип действия. Сперва расходящийся пучок света становится параллельным, после чего преломляется в окуляре, чтоб наблюдающий мог разглядеть картинку.

  1. Окуляр
  2. Тубус
  3. Держатель
  4. Винт грубой фокусировки
  5. Винт точной (микрометренной) фокусировки
  6. Револьверная головка
  7. Объектив
  8. Предметный столик
  1. Осветитель
  2. Ирисовая полевая диафрагма
  3. Зеркало
  4. Ирисовая апертурная диафрагма
  5. Конденсор
  6. Препарат
  7. Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое объективом
  8. Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре
  9. Объектив
  10. Окуляр

Принцип и преимущества

Ограничения классического оптического микроскопа

В широкопольной оптической микроскопии, чтобы изображение было четким, объект должен находиться в фокальной плоскости оптической системы. Когда объект толстый, имеет значительный рельеф или когда он наклонен относительно линзы, на изображении видна только часть объекта (см. Статью о глубине резкости ).

Кроме того, чем выше увеличение, тем ниже эта глубина, что не позволяет получить четкое изображение на всем слегка протяженном объекте. Это особенно раздражает для удлиненных объектов, например нервов  ; поэтому они расплывчаты на части своего маршрута, независимо от навыков подготовителя. Это также проблема для шероховатых или искривленных поверхностей, таких как фации трещин .

Фактически, широкопольная микроскопия представляет проблему для всех объектов, объем которых не является тонким срезом, перпендикулярным оптической оси:

  • в отражении для поверхностей, не являющихся плоскими и перпендикулярными оптической оси;
  • во флуоресценции для всех толстых предметов.

Действительно, свет, излучаемый фокальной плоскостью, поэтому чистый, теряется во флуоресценции, излучаемой плоскостями, смежными с фокальной плоскостью, которые по определению размыты.

Принцип конфокального микроскопа

Чтобы решить эту проблему, поверхность теперь освещается не лучом белого света, создаваемым лампой (10), а лазерным лучом , сконцентрированным линзой (идентичной оптическому объективу (11) в случае схематическая диаграмма Марвина Мински, приведенная выше в 1957 г.), который сканирует поверхность, размещая точечное отверстие (24) — точечное отверстие на английском языке — перед детектором (28) в фокальной плоскости, сопряженной с фокальной плоскостью объектива ( конфокальные планы). Таким образом, только фотоны, выходящие из фокальной плоскости, проходят через точечное отверстие (24) и участвуют в формировании изображения, отсюда и название «конфокальный» (синоним монофокального).

Свет от соседних плоскостей (размытый) блокируется краями отверстия. Таким образом, можно получить четкий оптический разрез, соответствующий только фокальной плоскости. Изменяя эту плоскость, мы получаем последовательность секций, дающих ясную и точную информацию в трех измерениях наблюдаемого объекта.

Конфокальная микроскопия позволяет фиксировать оборудование для исследований, но также позволяет изучать динамические явления на клетках или живых тканях, в частности, через молекулы семейства GFP ( G reen F luorescent P rotein ). Кроме того, постоянное развитие техники теперь позволяет изучать процессы молекулярного взаимодействия (метод FRET ) или молекулярную динамику ( FRAP , FLIP ).

разрешение

Пример применения.

Разрешение конфокального микроскопа можно определить экспериментально или теоретически с помощью функции рассеяния точки ( Point Spread Function , или PSF на английском языке ). В обычной световой микроскопии образец освещается широким полем и отображается объективом микроскопа, так что PSF всей системы определяется только детектирующей PSF используемого объектива микроскопа. С другой стороны, в конфокальной микроскопии свет (часто от источника когерентного света, такого как лазер ) фокусируется на образце, и в этом случае общая PSF, следовательно, является продуктом PSF освещения и детектирования. Это приводит к немного лучшему латеральному разрешению (180–160 нм ), чем ожидалось для обычного оптического микроскопа ( 200 нм ). Разрешение по Z (глубина) составляет порядка 600 нм в конфокальной микроскопии.

Гость форума
От: admin

Эта тема закрыта для публикации ответов.