Виды и типы микроскопов, их назначение, особенности работы

Оглавление

Устройство микроскопа

Основными оптическими системами микроскопа являются: ∙

Осветительная (в том числе, конденсор )
Воспроизводящая (в том числе объективы ).
Наблюдательная (окуляры )

Осветительная система микроскопа представляет собой систему линз, диафрагм и зеркал (последние применяются при необходимости), обеспечивающую равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива. Осветительная система микроскопа проходящего света включает также источник света, и оптическую систему, состоящую из коллектора и конденсора.

Источники света в микроскопе могут быть естественными и искусственными.

Микроскопы бывают разные, некоторые работают при помощи солнца, некоторые при помощи электрического освещения.

Увеличивает микроскоп при помощи линз, сделанных из стекла. Линзы собраны в группы и названы объективами и окулярами. Объектив увеличивает изображение объекта от 4 до 100 крат. Окуляры дают возможность посмотреть на изображение увеличенное объективом и сами увеличивают изображение на 5-25 крат.

Окуляр вставлен в окулярную трубку,а в револьвер установлены несколько объективов(4Х; 10Х; 40Х). Револьвер позволяет быстро изменять увеличение микроскопа. Ручки грубой и тонкой настройки позволяют быстро настроить фокус микроскопа на предмет.
Дисковая диафрагма позволяет изменять количество света. Бывают микроскопы бинокулярные для работы двумя глазами. Для длительной постоянной работы лучше иметь бинокулярный микроскоп, потому что когда постоянно зажмуриваешся портится зрение.

Объективы

Объективы, входящие в комплект микроскопа, рассчитаны на механическую длину тубуса 160 мм, высоту 33 мм, линейное поле зрения в плоскости изображения 18 мм и толщину покровного стекла 0,17 мм. Микроскоп укомплектован ахромат объективами с увеличением 4×, 10×, 40×. На корпусе каждого объектива ненесены линейное увеличение и числовая апертура и имеется цветовая маркировка, соответствующая увеличению.

Характеристики объективов
Увеличение	Числовая апертура	Цвет
4×	0,1	красный
10×	0,25	желтый
20×	0,45	зеленый
40×	0,65	голубой
60×	0,85	синий
100×ми	1,25	белый

Объективы увеличением 40×, 60×, 100× имеют пружинящую оправу для предохранения от механического повреждения фронтальной линзы объектива и объекта. Объектив 100× рассчитан на работу с масляной иммерсией.

Окуляры

В комплект микроскопа могут входить различные окуляры.

Окуляры
Маркировка	Увеличение	Линейное поле
5×	5	20
10×	10	13
16×	16	10

Предметный столик

Прямоугольный не перемещаемый предметный столик (рис. «Внешний вид микроскопа Биомед 1″) размером 110мм х 120мм. Объект крепится на поверхности столика двумя держателями препарата (рис. «Внешний вид микроскопа Биомед 1»).

Подготовка микроскопа к работе

Освободить микроскоп от упаковки.
Проверить комплектность микроскопа по прилагаемому паспорту.
Произвести внешний осмотр микроскопа и принадлежностей, убедиться в отсутствии повреждений.
Вставить в окулярную трубку окуляр (рис.»Внешний вид микроскопа Биомед 1″).
Поднять тубус вращением рукоятки грубой настройки (рис.»Внешний вид микроскопа Биомед 1″).
Объективы (рис.»Внешний вид микроскопа Биомед 1″) должны быть установлены в гнезда револьверного устройства (рис.»Внешний вид микроскопа Биомед 1″) в порядке возрастания.
Направить свет на объект исследования с помощью зеркального осветителя.

Микроскоп готов к работе

Преимущества люминесцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия имеет множество достоинств. Основным является возможность изучения живых клеток и микроорганизмов. Исключается опасность их соединения или окрашивания, что провоцирует гибель. Поэтому ученые могут:

наблюдать за клеточной структурой образца;
фиксировать динамику происходящих биологических изменений.

Пример наглядности результата

Ярким примером служит изучение глиальной ткани человеческого мозга с помощью оптического и фазово-контрастного устройства. При сравнивании изображения выводы может сделать любой человек, не имеющий специальных знаний.

При применении оптического микроскопа клетки мозга выглядят прозрачными. Можно увидеть только части, имеющие выраженное преломление, к примеру мембрану или ядро. Полученная картинка не подходит для подробного изучения образца.

При использовании метода фазового контраста детали хорошо различимы. На четком изображении видны мельчайшие клеточные структуры и места их соединения друг с другом.

Как интерпретировать

Образцы, окрашенные флюорохромами, рассматривают, увеличивая в 200-630 раз. Однако чаще используется значение 400. При изучении препаратов после обработки карболовым фуксином изображение увеличивают в 1000 раз. Поэтому поле зрения объектива на люминесцентном микроскопе намного больше, чем простом.

Строение микроскопа

Стандартный оптический прибор имеет в своем строении следующие детали:

насадку;
окуляр;
основание и штатив;
объективы;
револьверную головку;
предметный и координатный столики;
переключатель и осветитель;
винты макрометрической и микрометрической фокусировки;
конденсор с диафрагмой.

Оптическая система такого устройства представляет собой объективы, расположенные на револьверной головке, окуляры и в некоторых случаях призменный блок. При помощи оптической системы как раз и формируется изображение изучаемого образца на сетчатке глаза. Причем это изображение будет перевернутым.

В настоящее время многие детские микроскопы содержат в себе линзу Барлоу, применение которой позволяет добиться плавного увеличения изображения до 1000 крат и выше. Однако качество изображения при этом существенно страдает, что делает использование этой линзы в таких устройствах достаточно сомнительным.

В профессиональных устройствах для изменения увеличения используют только различные комбинации качественных объективов и окуляров. И уж конечно, в таких приборах никогда не будет использовать линза столько сомнительного качества.

Механическая система микроскопа представляет собой штатив, тубус, револьверную головку, механизмы фокусировки и предметный столик.

Для фокусировки изображения применяются механизмы фокусировки. Макрометрический винт применяют в работе с небольшими увеличениями, а микрометрический используется при высоких увеличениях. Стандартные школьные или детские микроскопы обычно комплектуются лишь макрометрическим винтом грубой фокусировки. Для лабораторных исследований в обязательном порядке понадобится и механизм тонкой фокусировки. Оптические устройства могут иметь раздельные механизмы грубой и точной фокусировки, а также содержать в себе коаксиальные винты микро и макрометрической регулировки фокуса.

Фокусировка прибора осуществляется при помощи перемещения предметного столика или тубуса устройства в вертикальной плоскости.

Предметный столик необходим для расположения на нем объекта. Можно выделить несколько их разновидностей:

стационарный;
подвижный;
координатный.

Более комфортным для работы считается координатный предметный столик, которые позволяет перемещать образец для исследования в горизонтальной плоскости.

Объективы микроскопа располагаются непосредственно на револьверной головке. Ее вращение позволяет выбрать какой-либо из объективов, тем самым меняя увеличение. Профессиональные устройства оснащены как правило съемными объективами, которые вкручиваются в револьверную головку. Дешевые же варианты микроскопов имеют встроенные объективы.

Тубус микроскопа содержит в себе окуляр. В устройствах с тринокулярной или бинокулярной насадкой существует возможность регулировки расстояния между зрачками, а также коррекции диоптрий, что позволяет подстроить микроскоп под индивидуальные особенности каждого наблюдателя. В детских устройствах в тубусе помимо окуляра может находиться также линза Барлоу.

Осветительная система оптического устройства представляет собой диафрагму, конденсор и источник света.

Источник света может быть как внешний, так и встроенный. Стандартный микроскоп обычно включает в себя нижнюю подсветку. В некоторых детских устройствах иногда используют боковую подсветку, но она не несет за собой никакого практического эффекта.

Лучшие материалы месяца

Коронавирусы: SARS-CoV-2 (COVID-19)
Антибиотики для профилактики и лечения COVID-19: на сколько эффективны
Самые распространенные «офисные» болезни
Убивает ли водка коронавирус
Как остаться живым на наших дорогах?

Конденсор и диафрагма используется для регулировки освещения микроскопа. Конденсоры могут быть однолинзовыми, двухлинзовыми или трехлинзовыми. При опускании или поднятии конденсора происходит либо рассеивание, либо конденсирование света, который освещает исследуемый образец.

Диафрагма представлена в двух вариантах: ирисовая, с плавным изменением диаметра, и ступенчатая, состоящая из нескольких отверстий разных диаметров. Соответственно увеличивая или уменьшая диаметр светового отверстия можно ограничить или увеличить поток света, льющегося на образец. Некоторые конденсоры оснащаются фильтродержателем, в который могут вставляться различные светофильтры.

Кратко о методе флуоресцентной микроскопии

Метод основан на способности фоточувствительных молекул к структурной интеграции с микрообъектами. Они прикрепляются к образцам с помощью функциональных химических групп и при световом облучении возвращают часть поглощенных фотонов.

Исследователи принимают и анализируют интенсивность волновых сигналов, делая выводы о строении изучаемых объектов и протекающих в них процессах.

Принцип флуоресценции соединений.

Какие процессы участвуют

При флуоресценции происходят поглощение квантов и их последующее частичное высвобождение. Электроны облучаемого флуорофора приобретают дополнительную энергию и на мгновение перемещаются на более высокий энергетический уровень.

При возвращении в первичное состояние происходит высвобождение фотонов во внешнюю среду. В этом процессе часть энергии тратится на восстановление термодинамического равновесия, поэтому величина испускаемой волны больше длины волны возбуждения. Разницу между энергиями возбуждающего и испускаемого излучений называют стоксовым сдвигом.

Формирование изображения

Микроскопы оснащены электронными модулями, позволяющими визуализировать исследуемые объекты при низких уровнях световых сигналов. Эти узлы содержат устройства с зарядовой связью, способные преобразовывать волновую энергию в фототок.

Далее электрические заряды сканируются регистрами сдвига и преобразуются в аналоговые, а затем в цифровые сигналы. На основе полученных данных формируется изображение высокого разрешения в 12- или 16-битном формате.

Ключом к качественной визуализации является правильный подбор оптических фильтров, гарантирующих надежное разделение испускаемого тусклого от возбуждающего яркого света.

Оптическая схема микроскопа.

Что такое люминесцентная микроскопия

При физическом процессе соединения поглощают фотоны. Одновременно у веществ появляется излучение с иной длиной волны. У получившихся фотонов она больше, но энергии меньше. Когда соединения облучают ультрафиолетом, отдельные из них светятся. Цвет излучения направлен к красной спектральной части.

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться.

Люминесцентные устройства функционируют в отраженном свете. Основной задачей при применении флуоресценции является отделение потока света объекта от сильного излучения подсветки. Чтобы увеличить наглядность изображения, используется темный или черный фон.

Принцип работы

Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) — это тип электронного микроскопа, который изображает образец, сканируя его сфокусированным пучком заряженных электронов в растровом сканирующем узоре (прямоугольном узоре захвата и реконструкции изображения). Различные сигналы, которые могут быть обнаружены, когда электроны взаимодействуют с атомами в образце, где сигналы могут быть интерпретированы в информацию о свойствах поверхности образца. Затем положение луча комбинируется с обнаруженным сигналом для получения изображения. СЭМ может достигать разрешения лучше, чем 1 нанометр. Образцы можно наблюдать в высоком вакууме, в низком вакууме, во влажных условиях, в окружающей среде, а также в широком диапазоне криогенных или повышенных температур.

Наиболее распространенным режимом СЭМ является обнаружение вторичных электронов, испускаемых атомами, возбужденными электронным пучком. Количество вторичных электронов зависит от угла, под которым пучок встречается с поверхностью образца. При сканировании образца и сборе вторичных электронов с помощью специального детектора создается изображение, отображающее топографию поверхности.

Как следует из названия, СЭМ использует электронную пушку, которая испускает сфокусированный пучок электронов высокой энергии, заменяющий источник света, используемый в оптическом микроскопе.

Достоинства

Сила увеличения составляет около 300 000 х по сравнению с несколькими сотнями раз, которые производит оптический.
Обеспечивает большую глубину резкости по сравнению с оптическими, что позволяет сложным 3D-объектам оставаться четкими и в фокусе.
Можно делать высококачественные цифровые фотографии всего, что видно в это устройство.

Недостатки

Недостатки обычного СЭМ заключаются в том, что образец должен быть твердым и небольшим, чтобы он мог поместиться внутри камеры.
Очень легкие элементы, такие как H, He, Li и элементы, которые находятся ниже атомного номера 14, не могут быть обнаружены с помощью этого типа.
Самые дешевые стоят около десятков тысяч долларов и являются достаточно громоздкими и сложными инструментами, требующими высокой технической экспертизы и подготовки при обращении.

Таким образом, эти факты ограничивают использование при исследованиях и промышленном применении.

Сфера применения люминесцентной микроскопии

Флюоресцентный микроскоп незаменим в биологии, медицине, а также смежных областях. Он позволяет проводить точные исследования клеток и тканей организмов. Главным преимуществом люминесцентной микроскопии считается возможность увидеть образец изнутри. Остальные приборы изучают лишь поверхность объекта.

Метод люминесцентной микроскопии применяется для исследования клеток организма.

Флюоресцентные устройства часто используют криминалисты. Они сравнивают образцы тканей и веществ для установления их принадлежности. Свечение применяется в санитарно-эпидемиологических исследованиях. Оно помогает выделять бактерии и клеточные структуры из-за способности взаимодействовать лишь с нужными красителями.

Явление флуоресценции открыли в 1852 г., но громоздкие микроскопы имели плохое разрешение. Новейшие технологии позволяют использовать люминесцентные ферментные метки, делающие устройства компактными. Их разрешение обладает высоким качеством.

Метод люминесцентной микроскопии является незаменимым для:

анализа кровяных клеток костного мозга;
диагностики инфекционных болезней;
исследования клеток организма и глазных тканей сетчатки.

Применение эффекта свечения нужной длины волны у молекул помогает распознать вирусы и бактерии с высочайшей точностью.

Световая микроскопия

В основе световой микроскопии лежат различные свойства света. Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Современные световые микроскопы представляют собой довольно сложные приборы, совершенствующиеся в течение 400 лет с момента создания первого прототипа микроскопа.

Освещение при микроскопии играет весьма существенную роль.

Неправильное или недостаточное освещение не позволит использовать полностью все возможности микроскопа.

Хорошее освещение достигается при установке света по методу Келлера. Для этого устанавливают осветитель на расстоянии 30-40 см от микроскопа и, перемещая патрон с лампочкой или весь осветитель, добиваются четкого изображения нити накала лампы на закрытой полностью диафрагме конденсора так, чтобы это изображение полностью заполняло отверстие конденсора.

Закрыв диафрагму осветителя, открывают диафрагму конденсора и, перемещая конденсор, добиваются резкого изображения диафрагмы осветителя в поле зрения микроскопа. Чтобы яркий свет не слепил глаза, предварительно уменьшают с помощью реостата накал нити лампы.

И, наконец, с помощью зеркала изображение отверстия диафрагмы устанавливают в центре поля зрения, а диафрагму осветителя открывают так, чтобы было освещено все видимое поле зрения. Раскрывать больше диафрагму не нужно, так как это не усилит освещенности, а лишь уменьшит контрастность за счет рассеянного света.

Как работает микроскоп

В работе микроскопа присутствует тот же принцип, что и в телескопе-рефлекторе. В телескопе лучи света, когда проходят через стекло или стеклянную линзу, преломляются под определённым углом. Телескоп собирает параллельные лучи воедино в точку фокуса, откуда с помощью окуляра мы можем её видеть. Что касается микроскопа, то тут очень схожий принцип действия. Сперва расходящийся пучок света становится параллельным, после чего преломляется в окуляре, чтоб наблюдающий мог разглядеть картинку.

Окуляр
Тубус
Держатель
Винт грубой фокусировки
Винт точной (микрометренной) фокусировки
Револьверная головка
Объектив
Предметный столик

Осветитель
Ирисовая полевая диафрагма
Зеркало
Ирисовая апертурная диафрагма
Конденсор
Препарат
Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое объективом
Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре
Объектив
Окуляр

История создания микроскопа

Создание микроскопа имеет многовековую историю. Прибор прошел путь от простой трубки, в которую едва что-то можно было рассмотреть, до электронного устройства огромной мощности с большими увеличительными возможностями.

Один из первых микроскопов

Поскольку ранее наукой интересовались богатые люди, заказанные ими единичные экземпляры микроскопов украшались дорогими камнями и золотом, футляры для их хранения изготавливались из слоновой кости и ценного дерева.

В настоящее время существует множество микроскопов, они находят применение в разных сферах деятельности человека: медицине, промышленности, археологии, электронике и др.

Микроскоп Захария Янссена (XVI век)

Первый микроскоп создал нидерландский мастер по изготовлению очков Захарий Янссен. Это была обычная трубка с двумя линзами на концах. Настройку изображения выполняли, выдвигая трубку (тубус). Этот простой микроскоп стал основой для создания более сложных приборов.

Микроскоп Гука (середина XVII века)

Роберт Гук собрал очень удобную модель микроскопа: тубус можно было наклонять. Чтобы получить хорошее освещение, ученый придумал специальную масляную лампу и стеклянный шар, который наполнялся водой.

Микроскоп Галилея (начало XVII века)

Галилео Галилей доработал трубу Янссена, заменив одну из выпуклых линз на вогнутую. При выдвижении тубуса этот микроскоп служил еще и телескопом. Предположительно микроскоп Галилея изготовил мастер Джузеппе Кампаньи из дерева, картона и кожи и поставил на трехногую подставку из металла.

Микроскоп Левенгука (середина XVII века)

Изобретение Левенгука представляло собой две небольшие пластины, между которыми крепилась крошечная линза, а исследуемый объект помещался на иглу. Передвигать иглу можно было с помощью специального винта. Микроскоп мог увеличить изображение в 300 раз, что было немыслимо для той поры.

Микроскоп Иоганна ван Мушенбрука (конец XVII века)

Иоганн ван Мушенбрук создал необычный и простой в использовании микроскоп. Линза и держатель крепились с помощью подвижных соединений, названных «орехами Мушенбрука». Это придавало микроскопу большую гибкость.

Микроскоп Дреббеля (XVII век)

Микроскоп Дреббеля — это позолоченная труба, которая находилась в строго вертикальном положении. Работать за таким микроскопом было не очень удобно.

Микроскоп фирмы Шевалье (XIX век)

Наука шагнула далеко вперед. Фирма Шевалье стала производить микроскопы, объектив которых состоял уже не из одной простой, а из многих специально отшлифованных ахроматических линз. Это позволяло достигать большой мощности и передавать изображение без искажений и более четко.

Электронный микроскоп (XX век)

Появляются электронные микроскопы. Ученые заменили пучок света на поток микрочастиц — электронов. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, они управляют движением электронов с помощью магнитного поля.

USB-микроскоп (конец XX века)

USB-микроскоп — это небольшой цифровой прибор, который присоединяется к компьютеру через USB-порт. Вместо окуляра — маленькая веб-камера, которая посылает изображение прямо на монитор компьютера.

Оборудование — конфокальные микроскопы

Современные сверхточные конфокальные микроскопы, такие как Leica TCS SP8 позволяют получить максимально четкие и достоверные данные при проведении различных исследований. Широкий интерес к таким приборам возник в восьмидесятых годах прошлого столетия, из-за быстрого развития компьютерной техники и лазерных технологий.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия представляет собой разновидность оптической микроскопии. Ее особенностью является то, что лазерный луч фокусируется на определенную область по осям Х и У и формирует, таким образом, изображение. Отраженный свет демонстрируется на экране в виде растра. Размеры изображения напрямую зависят от разрешающей способности современной электроники, а также от размеров сканируемого растра.

Измерительные приборы, которые созданы с помощью современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, в наше время получили широчайшее распространение в разных сферах. По сравнению с обычной световой микроскопией конфокальная микроскопия обладает следующими преимуществами:

улучшенная разрешающая способность;
высокая контрастность изображения;
возможность проводить мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов;
возможность получения «оптических срезов» с трехмерной реконструкцией;
возможности использования способов цифровой обработки полученных изображений;

Из недостатков описанной аппаратуры можно выделить:

сложность настройки прибора;
отсутствие оптического изображения;
высокая стоимость приборов, также дороговизна их обслуживания.

В конфокальном микроскопе для управления всей системой используется специальный компьютер. Он позволяет сохранять изображения и детально изучать полученные данные. Для качественной обработки полученных изображений зачастую требуются достаточно большие вычислительные мощности, поэтому компьютер должен обладать довольно большой оперативной памятью. Для дальнейшего хранения информации требуется также и большая дисковая память. Для передачи изображений такой компьютер должен иметь USB-порт или CD/DVDRW. Также компьютер имеет возможность подключения к глобальной интернет или локальной сети.

Программное обеспечение, установленное в таких компьютерах, может быть базовым. Оно поставляется вместе с техникой и позволяет управлять всей системой и контролировать ее основные функции. Также для указанных компьютеров специально разрабатываются пакеты прикладных задач, которые заказываются дополнительно. Многие модели конфокальных микроскопов имеют специальный пульт управления, позволяющий настраивать их работу дистанционно.

Устанавливают описанные приборы в обычных лабораторных посещениях. Важнейшей процедурой в процессе эксплуатации конфокальных микроскопов является контроль за вибрациями. Для таких целей применяют специальное устройство, измеряющее уровень вибрации. Процедура контроля похожа на процедуру измерения аксиальной разрешающей способности ЛСКМ при помощи зеркала.

Конфокальная микроскопия стремительно развивается. Известные компании-производители представляют на рынке новейшие образцы конфокальных микроскопов, которые позволяют эффективно разделять лазерный луч возбуждения, а также люминесценцию. С помощью компьютера в таких приборах управляется светоделитель. Его спектральные свойства при необходимости могут достаточно быстро перестраиваться на несколько лазерных линий.

От: admin

Эта тема закрыта для публикации ответов.

Основные типы микроскопов и для чего они используются